抑制消减杂交技术
SSH 即抑制消减杂交技术是由Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制PCR , 并结合标准化(normalization 或equalization ) 和消减杂交( substractive hybridization)。抑制PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板, 使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列, PCR 中不能扩增, 从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA 的丰度, 即低丰度差异表达的基因不会丢失, 而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群( tester) 与驱赶基因群(driver) 间的同源序列。
存在于tester 中而不存在于driver 中, 或在tester 中较在driver 中有高水平表达。
①第一次差减杂交,用过量的drivercDNA分别与tester2adaptor1cDNA和tester2adaptor2cD2NA杂交。分别形成SSH技术原理图所示的tester单链片段a、tester双链片段b、tester2driver同源双链片段c和driver单、双链片段d。根据杂交二级动力学,丰度较高的分子产生同源杂交体(homo2hy2brid)的速度较快,使高丰度与低丰度单链片段a浓度大致相等,从而实现tester单链片段a的标准化[6],并使连接一种接头的差异表达基因a初步富集。②第二次差减杂交,将上述分别与drivercDNA杂交后的tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA混合,再加入新制备的变性drivercDNA,因tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA同源,除形成a、b、c、d片段外,又形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段e,即连接两种接头的差异表达序列e,是进行PCR指数扩增的模板。
PCR之前填补分子粘性末端以利于退火。第一轮PCR,加入针对adaptor1和adaptor2外侧序列的特异引物进行扩增。结果:a、d片段因没有引物结合位点,不能进行PCR扩增;b片段由于两端均为同一接头,具有反向末端重复序列(invertedre2peats),在单链内部形成互补发卡结构的可能性及稳定性均大于引物与其配对结合的可能性及稳定性,故在PCR反应中不能扩增;c片段的一端为一种接头而另一端无接头,只能线形扩增;只有e片段末端有两种不同接头,可通过PCR作指数扩增。第二次PCR,加入一对与接头内侧序列相同的巢式PCR特异引物,进一步富集差异表达序列并降低背景。经过两轮PCR,基于PCR抑制效应的存在,以及选用了两对引物,可以特异扩增代表了差异表达的cDNA片段。
经上述PCR所得的差别表达基因片段可以利用接头上存在的酶切位点,插入适当载体,转化细菌。经X2Gal蓝白菌落初步筛选,获得具有差异表达cDNA片段的阳性克隆。然后通过Northern杂交鉴定,cDNA序列分析,可获得一些新的ESTs序列,如进一步对该ESTs进行深入的结构和功能研究,可望获得新的具有重要生物学作用的全长功能基因。