柱层析技术
柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。
根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
柱层析分离净化的实验技巧和方法1 柱层析操作方法的选择
目前 ,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、 减压分离和加压分离 3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、 简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量 ,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结 ,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度 ,缩短样品的洗脱时间 ,是一种比较好的方法 ,与常压柱类似 ,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气 ,双连球或者小气泵等。
2 柱子规格的选择
市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～40倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。
3 装柱
柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 ,湿法省事 ,一般用淋洗剂溶解样品 ,也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等 ,但溶剂越少越好 ,不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 ,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢 ) ,并且一定要均匀 ,不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ,大多数情况下有些小气泡没太大的影响 ,因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。
4 溶剂的选择
选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、 亲合性 (Affinity)和分离度 (Res oluti on)。溶剂应选择价廉、 安全、 环保的 ,可以考虑石油醚、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙醚、 甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高 ,乙醚很易挥发 ,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程 ,易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少 ,要依不同需要选择。另外值得一提的是 ,由于我们进行的是痕量分析 ,淋洗剂的纯度必须关注 ,一般使用农药残留级或 HPLC级的 ,如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用 ,一方面环保 ,另一方面也能节省部分经费。
5 上样
用少量的溶剂溶解样品加样 ,加完后将底端的活塞打开 ,待溶剂层下降至石英砂面时 ,再加少量的低极性溶剂 ,然后再打开活塞 ,如此两三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂 ,一开始不要加压 ,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 (2～4 cm) ,再加压 ,这样避免了溶剂 (如二氯甲烷等 )夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ,上样后在柱上又会析出 ,这一般都是比较大量的样品才会出现 ,是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,这样就必须用干法上柱了。
6 淋洗液的收集和浓缩
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话 ,就不容易流出 ,这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液 ,由于使用了较多的溶剂 ,必须进行浓缩 ,如果待测物具有一定的挥发性 ,最好使用常压挥发溶剂 ,否则易导致检测结果偏低。