植物基因组研究
美国的科学家们经过长达6年的争论后，终于在1990年正式开始了投资规模类似制造原子弹的曼哈顿计划和登月的太阳神计划的人类基因组计划（human genome project），旨在15年内，将人体基因组中3×109个碱基序列完全测定。随着此计划的实施，世界上很多国家的科学家们充分认识到了它的意义及对以后的科学发展的推动作用，不少国家均积极参与了此计划，也有很多科学家开始了一些作物及模式生物的基因组计划，形成了本世纪末的基因组研究热。由于投入这些基因组计划的经费很可观，参加人员数量多，分布面广，近两年来，这方面的研究进展很快，本文将对拟南芥菜和水稻的基因组计划的规划及进展作一简要介绍。
拟南芥菜基因组研究项目
因为植物对于人类的衣食住行有着很大的关系，因此对植物分子生物学的研究往往集中于一些重要粮食作物如水稻、小麦等及经济作物如油莱、大豆等。有人曾对基因库（GenBank）中有关植物的数据作了统计，其中有90％的DNA序列来自22种植物，而另外10％则来自于30种植物，这些研究一般都是针对某种植物的某个基因作的详细研究[1]。而随着研究的深入，植物学家越来越认识到对一个模式植物展开全面的分子生物学研究的重要性，因为随着对一些模式生物，如大肠杆菌、果蝇及线虫等的集中研究，越来越多的事实表明，对这些遗传及基因组背景相对简单的模式生物的研究将有助于人们对其他复杂的生物的研究及认识。基于这些事实，人们选中了一种毫无经济价值的小草——拟南芥菜（Arabidopsis thaliana）作为模式植物。最早以拟南芥菜为实验材料的是一些经典的遗传学家，但近5年来，越来越多的植物分子生物学家和发育学家开始用它作为实验材料，并于1990年形成了一个国际性合作研究计划——拟南芥莱基因组研究项目。
拟南芥菜属十字花科，拟南芥属，是一种分布很广的植物，它不仅基因组较简单，即染色体n=5，核基因组DNA含量=1.0×108碱基对。而且生命周期短，种子产量大，即一代的时间为3～5周，每个植株可产生无数粒细小的种子，亦有人将之称为植物中的“果蝇”。
1. 研究项目的组织及资助
拟南芥菜项目由多国科学家组成的委员会（MuItinationaI Science Streering Committee）统一协调。此计划的总目标是找出拟南芥菜基因组中全部的基因，并将此植物基因组完全测序。
任何基因组研究工作所需经费将是巨大的，拟南芥菜项目经费将由参加国各自承担。
北美方面，有四个美国国家机构支持此项研究：美国国家科学基金会（NSF）、能源部（DOE）、国立卫生研究所（NIF）和农业部（USDA），这四个机构在1990～1991年为此项目提供的经费达1500万美元，其中45O万是由国会为此计划直接拨给NSF的。英国农业食品研究委员会在1990年为拟南芥菜项目提供了约770万美元的为期三年的资助，欧共体为拟南芥菜项目设立了一个专门项目欧洲发育与生长生物技术研究（BRIDGE），由英国贝文（M. Bevan）负责协调，共有9个欧共体国家中的33个实验室加入了此项目， 1991～1992年的总经费为39O万美元。澳大利亚政府为该项目提供了15万澳元的起始经费，而一些参与此项目的单位，如一些大学和科研机构已提供了100万澳元的资助费。日本政府亦很重视这个项目，如文部省等国家机构均为此拨专项经费。另外，法国和德国的科学家也越来越多地加入了拟南芥菜的研究，两国政府也分别为他们的科学家提供了有关经费；苏联科学家利用拟南芥菜作为遗传研究的材料已有较长的历史，积累了较多的突变体系，现在他们已同意与拟南芥菜基因组项目的两个材料收集中心合作。
2．拟南芥菜计划的内容
计划最终目的不仅是鉴定出此植物中的全部基因和测得基因组全序列，而且要利用拟南芥菜这个实验模型，从分子水平上揭示有关植物的生理、生化、生长及发育活动的全过程，这将是一项浩大的工程，工程的组织者们也认识到这一点，他们对这项计划从以下几个方面作了近期和远期的规划。
（1）基因组的分析
基因组分析中包含的内容较多，主要分为三个紧密相连的部分，即作图、通过突变体研究基因功能和基因克隆及测序。
作图工作包括遗传作图和物理作图，遗传作图中又分以形态性状为标记的经典遗传图谱和基于内切酶片段长度多态性的遗传图谱，即RFLP图谱，此图谱的作图标记可为已知的DNA片段，或为用随机合成的DNA引物通过多聚酶链式反应扩增出来的DNA片段（RAPD）。科学家们已做出了两个拟南芥菜RFLP图谱，目前其上标有300多个标记；一个含120多个形态特征的遗传图谱和一个含有252个RAPD标记的RFLP图谱及日本科学家所作的另一个含有140个RFLP标记的图谱也近完成，现在科学家们正努力将这些遗传图谱结合起来以缩短各个标记之间的遗传距离。
物理图谱的制作工作分为几个层次，最详细的物理图谱将是基因组的DNA全序，这也是基因组计划的最终目标之一，要达到这个目标，必须经过很多艰苦的努力。目前能克隆大片段外源DNA的最佳载体为酵母人工染色体（YAC），自从1986年YAC被用来克隆大片段的外源DNA以来[2]，其载体发展很快，现已能克隆105～106碱基的外源DNA片段，而粘粒和噬菌体载体所能克隆的外源DNA片段分别为40×103碱基和20×103碱基左右。尽管YAC也有不少不尽人意的地方，如常常出现的外源DNA拼接在一起或重组的现象[3]，但它仍是目前为止最有效的克隆大片段外源DNA的载体。因此，YAC便成了连接遗传图谱和物理图谱的一座桥梁。科学家们现已构建了三个拟南芥菜的YAC库，其中已被鉴定和定位部分的总长度为33000×103 碱基，占拟南芥菜基因组的1／3，这些YAC库还被用来连接粘粒克隆，如古德曼（Goodman）等人构建的大约有20000个克隆的粘粒库，约可归纳为750组连续排列的克隆，若用标记了的YAC与那些排列好的粘粒克隆进行杂交，便有可能进一步将750组克隆连续地排列起来。而对YAC库中的克隆进行连续排列亦很重要，其方法有好几种，在此项目中主要用染色体步行和cDNA定位的方法。染色体步行的方法是利用YAC载体的特点，因为YAC载体上有大肠杆菌（E. coli）的复制起始位点和一些细菌体系的选择标记，将单个YAC克隆的DNA用特定的酶进行水解后，使酶解片段进行自动环化再对大肠杆菌细胞进行转化并在特定的培养基（如含安苄等）中进行筛选，便有可能得到含有部分载体片段（含有大肠杆菌的复制起始位点及选择标记）和紧接着载体片段的那段插入的外源DNA，即YAC中外源DNA的末端片段；或根据载体中的DNA序列，设计PCR的引物进行反向PCR，亦可扩增出大量含有部分载体片段和紧接着载体的部分外源DNA片段，用这段DNA与其他的YAC克隆进行杂交，便可望得到与之有重叠的克隆，这样一段一段不断地“走”下去，最后便可将一些YAC克隆连续排列起来。cDNA定位的方法即为在对cDNA克隆进行大规模测序的基础上，用这cDNA克隆与YAC库进行杂交，从而获得具有重叠序列的YAC克隆。
(2)突变体的研究
拟南芥菜基因组的目标之一便是利用基因突变的方法研究基因功能，在这方面，研究进展很快。产生基因突变的方法包括化学诱变，放射性照射，T-DNA或转座子插入等。以前的研究已鉴定了包括与花的形态发生有关的基因，涉及脂肪及氨基酸生物合成功能的基因，以及参与根的形成及生长的基因等200多个新的基因位点。现在，科学家们通过对胚胎及幼苗致死突变体的研究，发现大约有4000多个基因位点与胚胎及幼苗致死有关；对叶绿素缺陷型植物的研究又鉴定了500多个新的基因位点，若按拟南芥菜的基因组中有25000个单拷贝的转录单位来算，现在已鉴定了的基因位点约为这些转录单位的六分之一。最近的研究还表明，通过研究一些对病原菌或病毒有抗性或易感性的突变体与这些病原菌或病毒的相互关系，可将一些抗性基因定位在RFLP图上，为分离这些基因打下必要的基础。有的实验室已分离到可能含有抗性的基因的YAC片段。
(3)克隆及测序基因
随着拟南芥菜基因组计划的开展，基因克隆和测序工作进展得十分迅速，DNA数据库的统计结果表明，现在克隆并测得其序列的拟南芥菜基因已超过了300个。除了用经典的方法克隆基因外，现在用得较多的是跳跃子标记或T-DNA标记法(T-DNA tagging)[4]。在世界各地保存的约13000个拟南芥菜突变体中，有30％是由于某个基因中被插入 T-DNA而造成的，这些基因中因有 T-DNA插入，所以较易被克隆。在这方面进展较快的是对调控花形态发生发育基因的研究，如 APETALA3，LEAFY和 PISTLLATA等基因均已从一些无花瓣、花序发育受阻或雌雄蕊位置异常的突变体中克隆出来[5～7]，并发现这些基因具有较高的同源性，且与酵母和哺乳动物细胞中的转录因子在氨基酸水平上具有一定的同源性。另一类较有趣的是与病原菌侵染后反应有关的基因，如苯丙氨酸解氨酶(PALl)，苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)，谷胱甘肽-S-转移酶(GSTl)，B-l,3-葡聚糖酶(BGLl，BGL2，BGL3)及过氧化物歧化酶(SODl)[8,9]等等，均已被克隆和详细研究了。
(4)大规模测序
拟南芥菜大规模测序尚未开始，而小规模及中规模计划正在进行，欧共体所资助的小规模测序主要对象是那些已被研究得较透的基因组中的片段，其目标是每年测25×103碱基DNA，而中规模的测序计划目标是按每年1000×103碱基的速度对一些连续排列的DNA克隆进行测序。
大规模测序cDNA也是拟南芥菜基因组计划的策略之一，所得的已知序列的cDNA克隆可提供给作图人员用作标志，也可为分离测序完整基因提供探针。现在法国科学家已对600多个cDNA克隆进行了测序，发现有约三分之二的序列是新的，他们的目标是将3000～4000个 cDNA克隆部分测序；美国科学工作者则对拟南芥菜根、茎、叶和幼苗的cDNA进行部分测序，由于运用自动机械臂进行样品的处理和DNA自动测序仪进行测序，他们的进展较快，可在每周内完成200个cDNA克隆的部分测序(每个克隆约测500碱基对)。
3．技术开发
(l)转化方法
由于发现了一些高效转化的拟南芥菜品种，其转化在不少实验室已成了常规手段。一些科学家还发现，对去了顶芽的拟南芥菜进行土壤农杆菌接种，至少有五分之一的植株能产生被转化的后代，这样就可避免对特定品种的要求和大量组培及筛选的工作；另外，科学家们还在研究用原生质体进行大规模的转化和植株再生的方法，并探索用植物人工染色体(PAC)来克隆大片段外源 DNA的方法。
(2)克隆基因的新方法
①染色体步行(chromosome walking)：由于拟南芥菜的基因组相对较小及分散在基因组中的重复序列相对较少，因此一旦基因被定位在RFLP图上，即可用其两边的RFLP标记作探针进行染色体步行工作，这种工作一般都在以酵母人工染色体为载体的克隆上进行，再辅助于相应的cDNA克隆。现大约有40个参加拟南芥菜项目的实验室正在进行这项工作，用这种方法克隆的基因有编码脂肪代谢途径中一个酶的基因及一个与调节对外源生长激素反应有关的基因。其他正进行的工作包括分离参与植物病原体反应、光激素、光敏色素等的基因以及调控花的发生发育的基因等。这种做法一般要涉及到基因组中1000×103碱基以上的片段，花费时间及经费多，工作量大，但仍为分离、克隆和研究特定基因的较有效的方法。这种方法的另一优点便是它将所涉及到的YAC克隆连接排列起来。用这种方法鉴定出的YAC现已占拟南芥菜基因组的三分之一，而YAC中插入的外源DNA片段越大，这种方法越有效。
②插入突变法：用T-DNA标记方法是目前克隆基因的最有效的方法之一，美国杜邦研究中心已将含有T-DNA插入的突变体分发给135个参加此项目的实验室，此外还有一些实验正用此方法诱变植株，目前大约有800个突变体己被鉴定，它们包括花发育突变体，胚胎缺陷型突变体，幼苗致死突变体，株型大小及色素突变体以及其他一些形态突变体。除了T-DNA以外，Ac-Ds转座子也被用于诱发突变体，这方面的工作正进行之中。
4．生物资源中心
生物资源中心的主要任务是为各有关研究单位收集、保存和分配拟南芥菜的种子和DNA样品。这样的中心一共有三个，一是美国俄亥俄州立大学的生物资源中心(ABRC)，二是英国诺丁汉大学拟南芥菜种源中心(NASC)，三是德国科隆的DNA资源中心。这几个中心，尤其是ABRC和NASC分别负责向美洲及美洲以外的国家提供各种突变体及重组自交体系的种子；这些中心均将有关信息贮入计算机，各地研究人员可通过电子信箱(E-Mail)向中心索订所需的种子。另外，ABRC中心还存有各种质粒、粘粒及YAC克隆；德国科隆中心也收集有cDNA及核DNA文库，并向项目参加者提供他们所需的材料。
5．信息系统
为了适应日益增长的研究结果和及时地分析管理好这些数据，英国及法国科学家专门为拟南芥菜项目编写了数据库AAtDB，其中包括的内容很多，主要有4个方面。第一为有关作图方面的信息，其中包括含有14000多个粘粒克隆的YAC物理图谱、RFLP图谱及遗传图谱，各种作图的标记如RFLP标记等，及一些作图所用的主要的数据资料；第二是有关DNA序列方面的数据，GenBank中心所有有关拟南芥菜的序列分析均被收入AAtDB，其中还含有多肽序列及内切酶位点等方面的分析功能；第三是在前文所提到的各中心保存的各种株系和突变体之类的目录，及它们的形态描述；第四是500多位拟南芥菜研究者的通讯录和从1964年始至今的有关拟南芥菜的研究文章2700多篇。
目前，AAtDB的操作系统是Unix工作站，X-窗口(X-Windows)，适用Mac机的版本正在开发中，此数据库中心在美国波士顿市的麻省总医院和哈佛大学。
科学家们还在开发能适用于各种微机或工作站并能通过电子信箱存取的数据库，同时，他们与其他基因组项目的科学家们合作，建立 cDNA数据库， 以便使那些已被部分测序的 cDNA序列能及时地收入其中。
信息中心目前正讨论在欧洲建立类似的数据信息中心的必要性和可行性。
6．通讯交流系统
除了较早开始的一些邮寄刊物，如德国法兰克福大学克兰兹(Kranz)编辑的“拟南芥菜信息服务”，英国弗兰德斯(Flanders)等人编的“拟南芥菜通讯”外，近两年来美国GenBankBIOSCI传播中心设立了有关拟南芥菜信息的电子信箱，这样，研究人员可以通过电子信箱直接交流有关实验程序、研究报告、研究结果及各种有关会议的情况等，仅1992年上半年就交流了344条信息。这些信息均被分门别类贮存入计算机系统中。另外，拟南芥菜的研究者们还定期召开拟南芥菜研究大会，不定期地召开研讨会，如去年在美国波士顿召开的一个研讨会上，科学家们一致认为应尽早地建立起cDNA部分序列的数据库，以便cDNA大规模测序及分析的有效进行，与会者还就美国国立卫生研究院提出的cDNA专利问题进行了讨论，并取得了共识，即不用拟南芥菜的cDNA部分序列去申请专利。
水稻基因图谱计划
拟南芥菜是一毫无经济价值但具较高科研价值的模式植物，而水稻则因其重要的实用价值而被很多科研工作者所青睐。中国是一个水稻大国，开展水稻基因图谱的研究项目，无论从基础理论研究还是应用研究上都有很重要的意义，同时，此项目的开展还将有利于国内生物科研队伍的建设及为吸引留学人员回国创造条件。
在中国于1992年8月正式宣布开展水稻基因图谱计划以前，日本已开展了同样的研究。日本水稻基因组研究项目于1991年10月正式开始，由日本农林水产省和日本赛马协会资助，农业生物资源研究所的农林水产技术革新学会具体执行，在他们制定的1991～1997年的计划中，头四年将重点放在作遗传图谱（如RFLP图谱和经典形态图谱)，构建YAC、粘粒及噬菌体等文库，及一些组织特异性cDNA文库。后三年主要是作染色体图谱，对cDNA进行具体分析，并分离和分析完整的基因。在此同时，对各种分离出的DNA片段进行测序，并将力量集中在第六条染色体上，他们认为一些与抗性有关的基因位于此染色体上。
由于日本在开展水稻基因组研究项目以前就有好的作图基础，去年此项目组发表的RFLP图谱上已有119个标记，根据他们的计划，在1992年底此图上将再增加500个标志，其中的一些DNA克隆亦可提供给其他科研人员作研究。
中国的水稻基因图谱项目由国家科委资助和领导，下设专家组，组长为中科院上海生化所的洪国藩教授，副组长为北京大学生物系主任陈章良教授，具体参加的科研单位共有六个。其中心实验室在中科院上海生化所，其他五个卫星实验室分别是北京大学生命科学院，复旦大学生命科学学院，中科院遗传所，华中农业大学和中国水稻研究所。
中国水稻基因图谱研究的第一个五年计划的重点是遗传作图，构建一些组织、器官的cDNA文库，并进行特异性表达基因的研究；同时引进一些技术及设备，包括YAC文库的构建技术及一些计算机数据库及分析软件。目前各项工作均在进行中。
各种生物基因组研究项目的开展将带动生物科学各个学科的不断深入，也将促进生物技术的快速发展。最近几年的人类基因组、酵母基因组及拟南芥菜基因组等研究项目的成果已充分说明了这一点。而预计在本世纪末完成的酵母和拟南芥菜基因组全序列的测定及分析结果也将会进一步完善现有的生物学理论，并为完成较复杂生物如人类、水稻等基因组的研究奠定不可缺少的基础。
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