质粒抽提
所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除 RNA，如何将质粒与细菌基因组 DNA分开，如何去除蛋白质及其它杂质。
【如何去除 RNA】
去除 RNA 相对比较简单，首先是使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA，则需要更烦琐的操作。
【如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开】
基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组 DNA 分开；二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。
【去除蛋白质及其它杂质】
基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。
经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如 CsCl 超离心。
【实验前方法/试剂的选择】
首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒 (>15 kb)，则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见“分子克隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。
【关于碱裂解法】
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。)。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 (似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性。) 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。
【质粒抽提的8 大窍门】
1：摇菌时间 - 过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。
2：起始菌体量 - 大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。
3：菌体的彻底悬浮 - 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
4：使用相对过量的试剂 - 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5：裂解时间 - 加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。
6：中和的操作 - 在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。
7：中和后的离心去蛋白 - 一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
【降低 RNA 残留的方法】
RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase。
【降低 gDNA 残留的方法】
gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。
【降低蛋白质残留的方法】
蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。
【降低质粒 Nick 的方法】
细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比前两者大。
【降低变性超螺旋的方法】
理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)
【关于质粒多聚体】
QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。
【提高得率的方法】
利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。