bcr/abl融合基因
慢性粒细胞白血病（Chronic Myelognous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。
1 abl、bcr基因结构人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2～11共12个外显子[1]。转录始自1b或1a,形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb, 合成的两种蛋白质分子量均约为145,前者定位于细胞膜,而后者主要在细胞核内。abl主要结构有N端的肉瘤同源2(srchomology,SH2)、SH1。SH2结合磷酸化的酪氨酸残基,SH1具有酪氨酸激酶活性[2]。近C端富含酸性氨基酸残基,可结合DNA。abl蛋白参与细胞周期调节[3]。在G0期,abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。在G1→S转变过程中,Rb被磷酸化,abl与之分离,并激活,使RNA聚合酶磷酸化,促进转录,细胞进入S期。bcr基因位于22号染色体长臂,有23个外显子[1]。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1～63个氨基酸是二聚体化结构,参与bcr蛋白多聚体的形成[4]。bcr蛋白参与细胞周期调节[5],但详细过程还不十分明确。
bcr基因断裂点集中在三个区域:主要(major bcr,M－bcr)、次要(minor bcr,m－bcr)和μ(μ－bcr)区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一,bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。慢性粒细胞白血病的bcr基因断裂点常位于M-bcr,主要是b2a2和b3a2[4],蛋白分子量为210kb。
2 分子生物学和血液学形态特点90%以上的CML患者的血细胞中出现Ph1染色体，t(9；22)(q34；q11)，9号染色体长臂上C-abl原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区（bcr）,形成bcr/abl融合基因。此基因产生一种新的mRNA,编码的蛋白为P210，P210具有增强酪氨酸激酶的活性，改变了细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，从而扰乱了细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制了凋亡的发生[6]。Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础,并可作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。依据Ph1染色体和bcr/abl融合基因，可将CML分为3类，第1类为Ph1阳性和bcr/abl阳性，其临床表现为外周血象白细胞升高，以骨髓粒细胞极度增生为主；第2类为Ph1阴性而bcr/abl阳性，这是一组异质性疾病，实际上属于Ph1阳性的CML范畴；第3类为Ph1和bcr/abl均阴性。前两者具有相同的临床表现和血液学特征，为典型的CML，后者为非典型CML。正确区分对临床治疗判定预后有一定的指导作用[7]。
3 bcr/abl融合基因检测3.1 Southern Blot
即DNA印迹，可以对bcr-abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。将经限制性内切酶酶切及琼脂糖电泳分离的DNA片段转移到固相杂交膜上，胚系DNA会产生特征性片段，但发生过基因重排的细胞DNA因酶切位点有所改变会产生有别于胚系的DNA酶切片段。大多数bcr基因的断裂点集中于5.8kb的主要断裂点集簇区(M-bcr)。从白血病患者白细胞中抽提的基因组DNA，经一组限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探针与之杂交。放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于CML患者，除可见到一条与胚系bcr基因组DNA相对应的条带外，其他的条带说明存在重排的bcr等位基因[8]。
3.2 RT-PCR
采用异硫氢酸胍酚、氯仿一步法提取细胞总RNA,方法见参考文献[9]，用RT-PCR技术扩增bcr-abl基因接合区mRNA是检测CML敏感而特异的方法,设计两对引物，先进行逆转录反应合成cDNA，再进行PCR扩增，取扩增后产物10μl,用2%的琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下观察结果。
3.3 实时定量PCR
PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增过程中，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光检测系统接受到荧光信号。每个模板的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标为起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值，然后根据待测样本的Ct值从标准曲线上计算出该样本的起始拷贝数。
另外bcr/abl融合基因编码的蛋白P210可以用Western印迹或酶联免疫反应加以检测[10]。
4 治 疗CML治疗的目的是控制血液学和遗传学异常、消除症状、最大限度地延长生存。
4.1 酪氨酸激酶抑制剂
既然酪氨酸激酶在CML的发生中起了关键作用,抑制其活性成为CML治疗的一个新途径。目前已经合成了较特异的abl酪氨酸激酶抑制剂，即STI-571（伊马替尼，格列卫）[11]。伊马替尼是2-苯氨嘧啶衍生物，它可以选择性地阻断ATP与Abl激酶结合位点,有效地抑制bcr-abl激酶底物中酪氨酸残基的磷酸化，使该酶失活,进而阻止了一系列的信号传导。伊马替尼也抑制c-kit(干细胞因子)和PDGFR(血小板衍化生长因子受体)的酪氨酸激酶活性[12]。实验表明，伊马替尼不杀伤bcr-abl- 细胞，只杀伤bcr-abl+ 细胞[11,13]。该药选择性抑制CML患者粒细胞-单核细胞集落形成单位(CFU-GM) 和爆式红系集落形成单位(BFU-E)的生长[13]，使骨髓或外周血单个细胞半固体培养中集落形成率降低92%～98%，对正常集落的形成没有影响[11,14]。伊马替尼通过抑制bcr-abl活性，使得参与细胞周期、粘附骨架形成等生理过程的多种基因转录发生改变，引起bcr-abl+ 细胞分化、凋亡[15]。
4.2 免疫治疗
机体抗肿瘤免疫的机制包括细胞免疫和体液免疫两方面，对CML主要以细胞免疫为主。CML对免疫治疗有效，包括INF-α、造血干细胞移植和供者淋巴细胞输注(DLI)，其机制为T细胞和其他免疫效应因子的参与[16]。INF-α通过和细胞膜受体结合，激活大量信号传导途径，调控相应基因转录，抑制白血病细胞增生、促进凋亡。另外干扰素还可通过免疫调节，增加染色体阳性细胞HLA分子的表达量，结合的白血病肽段可更有效地被抗原呈递细胞和T淋巴细胞识别，增加NK细胞和细胞毒性T细胞功能，从而杀伤白血病细胞[17]。
4.3 造血干细胞移植
异基因造血干细胞移植能根除Ph+ 克隆,恢复正常造血,使大部分CML患者真正达到治愈。因而目前仍认为治愈CML的唯一方法是异基因造血干细胞移植。许多因素可影响异基因移植的效果，如患者性别和年龄、移植时所处的病期、供者来源（相关或不相关）、组织相容性及从诊断到移植的时间等［16］。
4.3.1 异基因造血干细胞移植(SCT)时间 既往经验表明,当病情进展到加速或急变期后实施异基因SCT后效果不佳,多数专家主张应在慢性期移植,目前的结论是CML诊断后尽早(一年内)移植[18]。
4.3.2 IFN对移植影响 有不同观点,最近德国CML协作组的研究显示移植前停用IFN3个月以上再做移植,与从未用过IFN的病人做移植的效果相同;移植前3个月内用IFN则增加移植相关死亡率[19]。
4.3.3 干细胞来源 与骨髓相比,外周血采集物含有更多的CD34+ 细胞和10倍以上的淋巴细胞;移植后中性粒细胞和血小板的恢复均较快;慢性移植物抗宿主病(GVHD)的发生率较高和程度较重;移植后白血病复发率较低[20]。
4.3.4 去除T细胞 去除供体的T细胞可预防GVHD,其代价为移植物被排斥率增加,免疫重建延迟、复发率增加。对去T细胞移植后预防性的输注供体源的T细胞可降低复发率[21]。
4.3.5 供体选择 至今HLA相合的同胞供体仍是最佳选择。其它可供选择的有HLA相合或大部分相合的亲属供体、HLA相合的无关供体, HLA相合或大部分相合的脐带血。非同胞间的配型须采用分子生物学方法。一般说来, HLA相合同胞间移植的效果优于无关供体移植。
4.3.6 预防复发 慢性期移植后5年内复发率为0～30%,主要取决于移植方案和GVHD预防方式。去T细胞处理、GVHD预防力度强和进展加速期移植者复发率高[18]。
造血干细胞移植可使大部分CML患者获得治愈，但仍有少数病例会出现复发，DLI为复发的治疗提供了新的方法。异基因造血干细胞移植能治愈经选择的CML患者，其治疗作用依赖于移植物抗白血病作用，疾病复发后DLI可以重新诱导出现移植物抗白血病作用，并增强此作用，从而通过增强免疫治疗控制疾病复发[22]。