冰冻切片

优缺点

(一)冷冻切片的种类

冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。

(二)冷冻切片的目的

（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。

（2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。

（3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。

（4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。

（5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。

（6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。

（7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。

（8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。

（三）冷冻切片的制作方法

（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法

1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

3．冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

（一）优点：

1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。

2．快速，用时短。

3．组织变化不大。

4．能很好保存脂肪，类脂等成分。

5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。

（二）缺点：

1．不容易做连续切片。

2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。

3．不容易制作较薄的切片。

4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。

（三）主要应用于：

1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。

2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。

3．用于临床手术的快速病理诊断。

二、冰冻切片机的使用及注意事项

（1）新鲜的组织制备

组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（－78℃） ② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。

（2）固定组织的制备

为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

（3）恒冷箱温度

一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：

组织 刀温度 组织温度 恒冷箱温度

肝 -18 -10 -5

肾 -15 -8 -5

皮肤 -35 -10 -5

脑 -18 -5 -5

固定组织一般高3-5度

（4）抗卷板

抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜

（5）切片机

操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。 恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。

（6）切片刀

新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。

三、冰冻干燥

原理

为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。

过程

小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后，升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。

特点

能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。但仪器贵，需时长。

四、冰冻替代法

原理

低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。

过程

组织块骤冷→组织内的水，在低温（－40℃～－70℃）液体脱水剂中被替代（醇、丙酮），同时起到固定作用→脱水组织渐恢复到室温，用石蜡包埋。

特点

① 新鲜组织在24小时内制成切片

② 可保存较多的酶活性

③ 经济、简单且有重复性，但对细胞器保存不佳，不能用于电镜。