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多聚合酶链式反应

王朝百科·作者佚名  2011-03-18  
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1 PCR技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)又称“体外的基因扩增”是由美国某公司和加利福尼亚大学于1985年共同合作开发的一项基因工程技术。这一技术可以在几个小时内将pg(10-9g)水平的单链拷贝序列扩增至上百万倍,已广泛的在于多领域得到了应用[1]。近些年来,PCR技术得到了不断的完善,并衍生出了多种PCR技术(如反向PCR、多重PCR等技术)以及与PCR技术相关联的其它新技术(如RAPD、AFLP等分子标记技术)。

1.1 PCR技术的原理

PCR的基本原理是利用聚合酶依赖于模板的特征,在体外模仿体内天然的DNA复制过程。复制过程被限定在一对人工合成的寡核苷酸之间。这段寡核苷酸被称为“引物”,长度通常为20个核苷酸。

1.2 反应过程

PCR反应主要包括三个步骤:(1)DNA变性,它是加热使模板DNA双链解离,形成两条单链的过程;(2)引物退火,即将反应温度降低,使两个引物分别与变性的两条模板DNA单链的3’—端配对,这一过程也被称为复性;(3)延伸,在四种脱氧三磷酸核苷存在的条件下,由DNA多聚酶催化,使引物沿模板DNA单链的3’→5’方向延伸,合成出一条新的DNA链。

1.3 反应物主要成分

(1)寡聚核苷酸引物;(2)DNA模板;(3)dNTPs;(4)聚合酶(关键性试剂)。

1.4 基本操作

(1)依次在灭菌的微量塑料管中加入下列溶液,混匀后待用。

灭菌去离子蒸馏水 30μL

10倍扩增缓冲液 10μL

四种dNTPs溶液(1.25mmol/L/每种) 16μL

引物1(100pmol,溶于去离子水) 5μL

引物2(100pmol,溶于去离子水) 5μL

模板DNA(根据浓度取不同的量,一般为2μg)

补加去离子水至终体积为100μL

(2)94℃加热5min,使模板DNA完全变性,立即加入0.5μL Taq DNA聚合酶(4μg/μL~5μg/μL),充分混匀后,加入100μL轻型矿物油或液体石蜡将液面封闭,防止蒸发。

(3)按下表程序,进行扩增。

循 环 变性(94℃) 复性(50℃) 引物延伸(72℃)

第一次循环 5 min 2 min 3 min

中间循环

(25次~30次) 1 min 2 min 3 min

最后一次循环 1 min 2 min 10 min

(4)取出部分扩增后的DNA进行电泳分析,确定DNA的量及纯度。

(5)为去除油或液体石蜡的污染,需对样品进行重新提取。

 
 
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