RNAi外源筛靶技术

进行RNAi实验时，您是不是会碰到以下问题：1、 目的细胞暂时不易得到，比如说原代培养的细胞，稀有难得的细胞株或者目的细胞暂时还没有到位；

2、 目的细胞转染效率低（转染效率在60%以下一般都认为转染效率偏低）；

3、 目的细胞需要诱导才能表达靶基因；

4、 目前尚无靶基因的抗体。

当这些问题摆在我们面前，而实验又必须继续进行的时候……

可靠的解决方案——RNAi外源筛靶

技术路线：

1、制备至少叁个靶点RNAi质粒；

2、构建靶基因重组真核表达质粒：靶基因与报告基因融合。因为siRNA是在核酸水平起效，所以，一般我们只克隆靶基因CDS区片段。

3、将各RNAi质粒分别与靶基因真核表达质粒瞬时共转染入工具细胞。

（1）通过荧光显微镜检测实验组相对于阴性对照组（阴性对照siRNA＋靶基因真核表达质粒）报告基因的表达水平下降程度；

（2）用报告基因抗体进行WesternBlot检测，来间接反映靶基因siRNA的抑制效率。参考文献：

1. Takeshi Kawauchi, Kaori Chihama, Yo-ichi Nabeshima and Mikio Hoshino. Cdk5 phosphorylates and stabilizes p27kip1 contributing to actin organization and cortical neuronal migration. Nature Cell Biology, volume 8, number 1, January 2006:17-31.

2. Irena Crnkovic-Mertens, Julia Semzow, Felix Hoppe-Seyler, Karin Butz. Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livinβas key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells. J Mol Med (2006) 84: 232–240.