王朝百科
分享
 
 
 

菌落PCR

王朝百科·作者佚名  2012-03-09  
宽屏版  字体: |||超大  

菌落PCR(Colony PCR)可不必提取基因组DNA,不必酶切鉴定,而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增,省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

具体方法:

1、PCR混合物的制备

Taq buffer(10×) 20 ul

dNTP(2.5 mM) 5 ul

Primer Forward(50 mM) 10 ul

Primer Reverse(50 mM) 10 ul

ddH2O 147 ul

Taq(2U/ul) 8 ul

total 200 ul

将上述溶液混匀,10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子,用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体,在LB琼脂糖平板上轻点,做一拷贝;然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下(管子做好记号,如平板上点的是1#,则管子上也标1#,以便筛选到克隆后的扩到培养),盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中,按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜,使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板,直接接种摇菌,如果早上做PCR的话,下午就可以提质粒,得到重组载体。

注意事项:设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。

菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单,快捷,阳性率较高,在转化鉴定中较常见。

 
 
免责声明:本文为网络用户发布,其观点仅代表作者个人观点,与本站无关,本站仅提供信息存储服务。文中陈述内容未经本站证实,其真实性、完整性、及时性本站不作任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
如何用java替换看不见的字符比如零宽空格​十六进制U+200B
 干货   2023-09-10
网页字号不能单数吗,网页字体大小为什么一般都是偶数
 干货   2023-09-06
java.lang.ArrayIndexOutOfBoundsException: 4096
 干货   2023-09-06
Noto Sans CJK SC字体下载地址
 干货   2023-08-30
window.navigator和navigator的区别是什么?
 干货   2023-08-23
js获取referer、useragent、浏览器语言
 干货   2023-08-23
oscache遇到404时会不会缓存?
 干货   2023-08-23
linux下用rm -rf *删除大量文件太慢怎么解决?
 干货   2023-08-08
刀郎新歌破世界纪录!
 娱乐   2023-08-01
js实现放大缩小页面
 干货   2023-07-31
生成式人工智能服务管理暂行办法
 百态   2023-07-31
英语学习:过去完成时The Past Perfect Tense举例说明
 干货   2023-07-31
Mysql常用sql命令语句整理
 干货   2023-07-30
科学家复活了46000年前的虫子
 探索   2023-07-29
英语学习:过去进行时The Past Continuous Tense举例说明
 干货   2023-07-28
meta name="applicable-device"告知页面适合哪种终端设备:PC端、移动端还是自适应
 干货   2023-07-28
只用css如何实现打字机特效?
 百态   2023-07-15
css怎么实现上下滚动
 干货   2023-06-28
canvas怎么画一个三角形?
 干货   2023-06-28
canvas怎么画一个椭圆形?
 干货   2023-06-28
canvas怎么画一个圆形?
 干货   2023-06-28
canvas怎么画一个正方形?
 干货   2023-06-28
中国河南省郑州市金水区蜘蛛爬虫ip大全
 干货   2023-06-22
javascript简易动态时间代码
 干货   2023-06-20
感谢员工的付出和激励的话怎么说?
 干货   2023-06-18
 
>>返回首页<<
 
 
 
静静地坐在废墟上,四周的荒凉一望无际,忽然觉得,凄凉也很美
© 2005- 王朝网络 版权所有