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噬菌体载体

王朝百科·作者佚名  2012-03-16  
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噬菌体主主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。双链噬菌体为λ类噬菌体,单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。 重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。

目录

噬菌体载体种类λ类噬菌体载体插入型λ类噬菌体载体替换型λ类噬菌体载体M13噬菌体载体

噬菌体载体种类噬菌体载体

λ类噬菌体载体构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除,按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体,可以归纳成两种不同的类型:一种是插入型载体(insertionvectors),只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,另一种是替换型载体(rePlacementvectors),具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。

在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入,广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入,所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。插入型λ类噬菌体载体外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上,会使噬菌体的某种生物功能丧失效力,即所谓的插入失活效应。插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的(inactivatiortofimmunityfunction)和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的(inactlvatlonofE.coliβ-galactosidase)两种亚型。

①免疫功能失活的插入型载体:在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区,其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时,就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏,而不能进入溶源周期。因此,凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑,而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。

②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体:它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段,其中编码着β半乳糖着酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌,涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上,会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上,阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列,不能合成β-半乳糖昔酶,只能形成无色的噬菌斑。替换型λ类噬菌体载体替换型载体又叫做取代型载体(substitutionvector),是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。

λNM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中,可取代的EcoRI片段,编码有一个supE基因(大肠杆菌突变体tRNA基因),由于这种λNM781噬菌体的感染,寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了,能在乳糖麦康基氏(MacConkey)琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑,或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了,那么所形成的重组体噬菌体,在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。

M13噬菌体载体m13噬菌体载体

M13噬菌体是一类特异的雄性大肠埃希菌噬菌体,基因组为一长度6.4kb的且彼此同源性很高的单链闭环DNA分子。只感染雄性大肠埃希菌,但M13噬菌体DNA可以转传导进入雌性大肠埃希菌。M13子代噬菌体通过细胞壁挤出,并不杀死细菌,但细菌生长速度缓慢。

该类噬菌体作为克隆载体,可以通过质粒提取技术在细菌培养物中获取。M13噬菌体主要用于克隆单链DNA。

 
 
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