双向电泳
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）
是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.
样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生0～10%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.
2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.
分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.
较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.
常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。什么成分会影响 2D 胶的效果？核酸，盐，去垢剂等等。2D 胶的上样量应该在什么范围？上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（ 不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
附：双向电泳完整的操作步骤
（一）第一向等电聚焦
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。
4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE电泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
4. 配制胶条平衡缓冲液I。
5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7. 配制胶条平衡缓冲液II。
8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
20.进行染色。