ras基因
1 ras基因的发现
ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒(Ha2MSV)和
Kirsten鼠肉瘤病毒(Ki2MSV)的子代基因中被发现,在这种
子代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序
列[1],此后人们将这种宿主细胞基因称为ras基因.1982年
Weinberg和Barbacid首先从人膀胱癌细胞系中分离出一种
转化基因,可使NIH3T3细胞发生恶性转化,而从正常人组
织中提取的DNA则无此种作用.随后,Santos与Parada发
现上述转化基因并非新型基因,而是Harvery鼠肉瘤病毒
ras基因的人类同源基因,命名为H2ras.同年,Krontiris在
人肺癌细胞中发现Kirsten鼠肉瘤病毒基因的同系物,称为
K2ras.另一种相似的基因是在人神经母细胞瘤DNA感染
NIH3T3细胞时发现的与ras类似的基因,称为N2ras[2],此
种基因和病毒无关.
2 ras基因的结构
ras基因在进化中相当保守,广泛存在于目前研究的各
种真核生物如哺乳类,果蝇,真菌,线虫及酵母中,提示它有
重要的生理功能.哺乳动物的ras基因家族有三个成员,分
别是H2ras,K2ras,N2ras,其中K2ras的第四个外显子有A,
B两种变异体[3].各种ras基因具有相似的结构,均由四个
外显子组成,分布于全长约30kb的DNA上.它们的编码
产物为相对分子质量2.1万的蛋白质,故称为P21蛋白[4].
目前已证明,H2ras位于人类11号染色体短臂上
(11p15.1～p15.3),K2ras位于12号染色体短臂上
(12p1.1～pter),N2ras位于1号染色体短臂上(1p22～
p32),除了K2ras第四个外显子有变异外,每个ras基因编码
P21的序列都平均分配在四个外显子上,而内含子的序列及
大小相差很大,因而整个基因也相差很大,如人K2ras有
35kb长,而N2ras长为3kb.由于有两个第四号外显子,K2
ras可以两种方式剪接,但编码K2ras2B的mRNA含量高.
除K2ras2B含有188个氨基酸外,其他两种Ras蛋白均含有
189个氨基酸.
3 Ras蛋白的结构和功能
3.1 Ras蛋白的结构
Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白,相对分子
质量为2.1万,定位于细胞膜内侧.它由188或189个氨基
酸组成,它的第一个结构域为含有85个氨基酸残基的高度
保守序列,接下来含有80个氨基酸残基的结构域中,Ras蛋
白结构轻微不同,除了K2Ras末端25个氨基酸由于不同的
外显子而分为A型和B型外,其余Ras家族成员最后四个
氨基酸均为Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋白存在4
种异构型:H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B,它们是3种
基因的产物,其中K2Ras4A和K2Ras4B是同一基因不同剪
接的结果.
3.2 Ras蛋白的功能
Ras(P21)蛋白位于细胞膜内侧,它在传递细胞生长分
化信号方面起重要作用.它属于三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋
白(一种细胞信息传递的耦联因子),通过GTP与二磷酸鸟
苷(GDP)的相互转化来调节信息的传递.P21与GTP和
GDP有很强的亲和性,而且有较弱的GTP酶活性.正常情
况下P21和GDP结合并没有活性,当细胞外的生长分化因
子把信号传导到胞膜内侧的P21时,可增强P21与GTP结
合活性,使P21和GTP结合成为激活状态,信号系统开放.
因为P21有GTP酶活性,可使GTP水解成GDP,P21和
GDP结合后P21失活,信号系统关闭.正常情况下P21的
GTP酶活性很弱,当和GTP酶激活蛋白(GAP)结合后其水
解速度可提高1万倍而使P21失活.P21和GDP结合后可
以激活鸟苷酸释放蛋白(GNRP),GNRP使P21释放GDP
结合GTP,因此通过GTP和GDP的相互转化可以有节制
地调节P21对信号系统的开启和关闭,完成生长分化信号传
入细胞内的过程.
Ras蛋白在合成后,需要经过两种方式翻译后修饰,才
可定位于细胞膜内侧[5].①通过FTase在Ras蛋白羧基端
的CAAX四肽结构中的Cys残基上加上一个类异戊二烯基
团法尼基,随后AAX残基从C端上断裂脱落,法尼基化Cys
发生羧甲基化,此修饰使RasC端具有疏水性;②N2或H2
ras的半胱氨酸的S2酰基化,长链的S2酰基取代基使ras具
有疏水性.有研究表明,激活ras的表达能增强血管生长因
子(例如VEGF/VPF)的表达,提示Ras蛋白在血管生成中
发挥作用,抑制Ras蛋白活性能抑制依赖Ras蛋白的肿瘤细
4期顾华丽,田字彬1ras基因突变与肿瘤的关系373
胞增殖,也能干扰血管生成[6].同时,激活Ras蛋白还能抑
制凋亡.Ras蛋白过度表达还能增加药物和紫外光诱导的
凋亡,可能的机制是ras癌基因增强了细胞分解过氧化氢的
能力从而抑制凋亡[7].然而,这个假说还需进一步研究.
4 ras基因的活化机制
4.1 ras基因激活的方式
作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活
性的癌基因.ras基因激活的方式有3种:基因点突变,基因
大量表达,基因插入及转位.其中ras基因被激活最常见的
方式就是点突变,多发生在N端第12,13和61密码子,其中
又以第12密码子突变最常见,而且多为GGT突变成GTT.
不同突变位点对P21的活化机制不同,第12密码子突变可
以减弱P21内在的GTP酶活性,并使细胞凋亡减少,细胞间
接触抑制减弱[8];第61密码子突变可削弱GAP对P21的内
在GTP酶活性,并可减弱GAP与P21结合的稳定性[9].
4.2 ras基因突变致癌的机制
ras基因激活构成癌基因,其表达产物Ras蛋白发生构
型改变,功能也随之改变,与GDP的结合能力减弱,和GTP
结合后不需外界生长信号的刺激便自身活化.此时Ras蛋
白内在的GTP酶活性降低,或影响了GAP的活性,使Ras
蛋白和GTP解离减少,失去了GTP与GDP的有节制的调
节,活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使,造
成细胞不可控制地增殖,恶变.同时细胞凋亡减少,细胞间
接触抑制增强也加速了这一过程.
5 Ras2MAPK信号转导途径
5.1 Ras上游通路
Ras能被复杂的网络激活.首先,被磷酸化激活的受体
如PDGFR,EGFR直接结合生长因子受体结合蛋白(Grb2),
这些受体也可以间接结合并磷酸化含有src同源区2(SH2)
结构域的蛋白质(例如Shc,Syp)后,再激活Grb2.第二,
Grb2的src同源区3(SH3)结构域与靶蛋白如mSos1,
mSos2,C3G及发动蛋白(dynamin)结合.C3G与连接蛋白
Crk的SH3结构域结合后耦联酪氨酸磷酸化而激活Ras.
Crk也能结合mSos1激活Ras.Grb2与激活的受体结合促
进鸟苷酸交换因子(Sos)蛋白定位在与Ras相邻的细胞膜
上.这样,Sos与Ras形成复合体,GTP取代GDP与Ras结
合后,Ras被激活,当GTP水解成GDP后Ras失活.Ras具
有内在GTPase活性,它的活性可被RasGAPs调节,因而
RasGAPs扮演Ras活性调节剂的角色.另外,Ras失活也受
到高度调节.目前,有三种蛋白质能水解GTP使Ras失活,
它们分别是P120GAP,neurofibromin和GAP1m,统称为
RasGAPs.
5.2 Ras下游通路
5.2.1 Ras/Raf通路 至今,Ras/Raf通路是最明确的信号
转导通路.当GTP取代GDP与Ras结合,Ras被激活后,
再激活丝苏氨酸激酶级联放大效应,招集细胞浆内Raf1丝
苏氨酸激酶至细胞膜上,Raf激酶磷酸化MAPK激酶
(MAPKK),MAPKK激活MAPK.MAPK被激活后,转至
细胞核内,直接激活转录因子.另外,MAPK刺激Fos,Jun
转录因子形成转录因子AP1,该因子与myc基因旁的特异
的DNA序列结合,从而启动转录.myc基因产物也是转录
因子,它能激活其他基因.最终,这些信号集中起来诱导D
型Cyclin的表达和活性.D型Cyclin与Cyclin依赖性激酶
(如CDK4和CDK6)形成复合体,该复合体的形成促使细胞
从G1期进入S期.因此,Ras/Raf通路在受体信号和G1期
进展之间起着关键作用.然而,Ras/Raf通路不是调控G1
期进展的惟一通路.Ras与Raf单独结合不能促进Raf激
酶活性,同时,Raf能被不依赖Ras的机制所激活(例如能被
Src酪氨酸激酶和PKC所激活),MAPK也能被不依赖Ras
机制(如通过调节整合素的活性)所激活.表明级联反应每
一个信号蛋白质都能被多个上游蛋白质所激活,而它们也可
能有另外的靶蛋白.另一个重要的Ras通路效应物是Cyc2
lin依赖性激酶抑制剂P21Waf1/cip1,它被Ras所诱导,抑制
Cdk2CyclinE和Cdk2CyclinA复合体的活性,从而阻断DNA
的合成.
5.2.2 Rho/Rac通路 Rho家族蛋白质是小G蛋白的Ras
超家族成员,其氨基酸序列大约有30%与Ras蛋白相同,三
个主要的Rho蛋白是Cdc42,Rho,Rac.Cdc42刺激Rac,
Rac接下来刺激Rho.然而,这个直线模型对于精确的信号
转导通路来说过于简单,因为有证据显示交叉联系存在,例
如Cdc42不通过Rac能影响Rho的活性.下游靶点Rho激
酶α的激活,导致肌动蛋白的重新构建和P21激活的丝苏氨
基酸激酶参与应力纤维的分解.最后Rac和Cdc42利用
MAPK传递信号至核内,Rho通过刺激Src和fos启动子达
到转录调节的作用.另外,Rac和Cdc42激活JunN端激
酶,该酶结合Jun,EIk1和ATF2等转录因子,这就是Rho
在细胞癌变过程中起重要作用的可能机制.另一个重要
Rho下游靶点是P21Waf1/cip1.Rho抑制P21Waf1/cip1诱导,有利
于Ras驱动细胞进入S期[10],P21Waf1/cip1阴性细胞不需要
Rho进行Ras激活的DNA合成,降低了通过诱导P21Waf1/cip1
在Ras转化过程中的重要性.
5.3 Ras2MAPK信号途径与肿瘤的关系
肿瘤发生与调控细胞增殖的信号发生异常有关.一些
肿瘤病人生长因子或其受体的表达或功能出现异常,如卵巢
癌病人血清中EGF和胰岛素样生长因子含量升高;EGF增
高影响细胞间连接,促进细胞转移和浸润[11].临床资料表
明,酪氨酸蛋白激酶受体过表达与肿瘤相关,ErbB22在乳癌
病人中30%过表达;起源于上皮的肺癌,乳癌等EGFR过表
达,并与高转移率,低生存率以及差的预后相关,通过降低
EGFR表达可抑制EGFR过表达的卵巢癌细胞的增殖[12].
肿瘤细胞ras基因突变率大约为25%,而胰腺癌和结肠癌分
别达到85%和40%.ras癌基因主要以点突变和基因扩增
方式存在,突变位点在第11,12,13,18,59,61密码子,是
Ras蛋白和GAP的作用位点,由于突变,抑制了Ras内在的
GTP酶活性,突变的Ras锁定在持续激活的Ras2GTP状
态,引起细胞的恶性转化.raf癌基因与人类肿瘤关系密切,
很少突变,但Raf持续活化,可导致细胞恶性转化;在小细胞
肺癌病人的组织标本中,Raf在mRNA和蛋白水平均过表
达,活性增高.
在肿瘤治疗的研究中,可从以下几方面阻断Ras2
MAPK信号转导途径:①酪氨酸蛋白激酶抑制剂,如Radici2
col抑制V2Ha2ras转化的NIH3T3细胞的MAPK活性,使
细胞表型逆转;新研究的酪氨酸蛋白激酶抑制剂能双重作用
ErbB22和EGFR[13],广泛抑制ErbB22或(和)EGFR过表达
的肿瘤生长.②抑制Ras法尼基化:法尼基转移酶抑制剂
(FTIs)是目前研究的分子水平抗癌药,抑制ras翻译后修
饰,已有多种FTIs用于动物模型和临床前期实验,有明显的
抗肿瘤作用,如SCH66336对表达高水平H2Ras2GTP和ras
是否突变的肿瘤都有生长抑制作用,已进入临床试验[14].
③反义核苷酸技术:C2H2ras反义RNA质粒降低人胃癌
BGC2823细胞的H2ras表达并抑制细胞生长和部分恶性表
型逆转;Raf21反义DNA抑制人白血病细胞的增殖.④其
他:针对受体酪氨酸激酶与底物作用的SH2区或SH3区设
计多肽,在体外实验抑制酶和底物结合.
6 ras基因的临床应用
6.1 诊断
ras癌基因和P21在许多癌前病变中都有表达.Ochi
等[15]发现1例胰液中K2ras突变阳性而细胞学及影像学检
查均阴性的病例,随诊18个月后才发现恶性细胞及影像学
的变化.提示ras基因突变早于病理检出及临床表现的出
现.提示可用检测ras癌基因或P21的方法对癌变倾向提
供较早信息.Kimura等[16]检测切除的胰腺标本中K2ras的
突变率,在胰导管癌,胰黏液细胞癌和慢性胰腺炎中分别是
81%,53%和7%,相应胰液中的突变率分别为72%,53%和
0,所以检测胰液中突变的K2ras基因即可为临床诊断提供
有力的帮助.Futakawa等[17]检测52例胰腺癌病人胰液中
突变的K2ras基因和癌胚抗原水平,结果显示这两项指标联
合检测在胰腺癌诊断中的准确度是90%,因此可用联合检
测的方法及早而准确地诊断肿瘤.
6.2 病情评估及预后判断
Shirakawa等[18]通过检测P21,P53,Ki67和细胞角蛋白
10发现食管鳞癌的分化程度取决于发育不良的程度,而P21
在这个演化过程中起关键作用.Rak等发现突变的ras基
因可强效刺激血管内皮细胞生长因子的表达.Thebo等[19]
对有K2ras12或13密码子突变的DukesB2期结直肠癌进
行分析显示,80%的原发灶和局域淋巴结发生相同位点的
ras基因突变,说明ras基因突变对肿瘤淋巴结转移是高风
险因素.有文献报道,唾液腺癌中H2ras基因突变率与临床
病理指标呈高度正相关,可通过检测基因突变来推测肿瘤所
处的阶段和分化程度[20].可见检测突变的ras基因可为临
床病情的评估提供有力的依据.
Harada等[21]研究表明,P21(-)者5年生存率为
64.1%,(+)者为38.0%,(6)者为11.5%,P21是决定生
存率的重要而独立的指标.但许多文献报道ras基因突变
和临床病理指标及预后没有明显的关系.联合检测非小细
胞肺癌组织中K2ras,p53和cerbB2基因的异常表达,比单项
检测可明显地提高对预后的评估,因此,可用联合检测对某
种肿瘤较敏感的几个癌基因的方法来对预后进行评估.
6.3 治疗
研究表明,体外给予结肠癌细胞(HCT116/P21+/+)
P21反义寡脱氧核苷酸,可提高癌细胞对放疗的敏感性;用
末端含CAAX碱基的制剂作用于人类ras癌基因转染的动
物细胞,可抑制癌细胞的生长;用核糖酶(K2rasR2)拮抗突
变的K2ras12细胞系,可使细胞生长停止,凋亡增加,VEGF
基因表达受抑.可见用分子生物学的方法治疗肿瘤是有广
阔应用前景的.
总之,虽然对ras基因,Ras蛋白及Ras信号转导通路的
研究已达一定的深度,ras基因已在临床有一些应用,但仍有
许多问题需解决,如ras基因突变发生在肿瘤形成的那些阶
段,Ras信号转导通路与其他信号转导通路相互影响,相互
交叉,阻断单一信号转导通路能否真正起到改变或影响肿瘤
发生发展的作用等.随着对这些问题的研究,解决,人们将
对肿瘤的预防,诊断和治疗提供更新更有效的方法.