牙质片层
(可重吸收的牙质培养基)
产品
失活的牙质片层用作骨重吸收培养基.这些
片层以5 mm直径的牙质薄片形式提供(正常厚度
为0.3 mm).每批培养基均经过检测以确保被有
功能的破骨细胞重吸收.另可提供预重吸收的样
品片层以便于体外重吸收功能鉴定.
简介
牙质片层以50片一包形式供应,包装于已消
毒的旋转盖封容器内.该片层通过紫外线杀菌并
且只能在无菌环境(如层流柜)中打开.
储存
该产品可在室温下储存.如果容器不打开且
片层保持干燥,在保质期内不会出现变质.
应用
该产品被设计利用"骨切片检测"以实现体外
骨重吸收量化(1,2),在"骨切片检测"中,培养的破
骨细胞在矿化的底层挖掘出真正的骨重吸收间
隙.从该检测的第一个表述开始,在过去的16年
间(1,2),该检测已被广泛地应用于研究许多因素
对骨重吸收的影响且是当今体外骨重吸收研究使
用最广泛的方法(3-8).
骨切片检测能与从实验动物(包括小鼠,大
鼠,鸡,兔和猫)的骨分离的破骨细胞同时使用.
它已被广泛用于研究通过直接分离于骨或培养自
骨髓培养基的人破骨细胞重吸收 (4).
该领域当今主要优势之一是通过RANK配基
的增加从外周红细胞诱导破骨细胞形成的技术的
发展(9).利用这项技术,大量功能性破骨细胞能
被激活,被激活的功能性破骨细胞将在包括骨位
点重吸收的牙质片层在内的矿化底层挖掘出重吸
收间隙.重吸收很容易被反射光显微镜方法而量
化(3,4,6,8).
参考文献
1. Boyde A, Ali N N and Jones S J (1984) Resorption of
dentine by isolated osteoclasts in vitro. Br. Dent. J.
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3. Walsh C A, Beresford J N, Birch M A, Boothroyd B and
Gallagher J A (1991) Application of reflected light
microscopy to identify and quantitate resorption by isolated
osteoclasts. J. Bone Miner. Res. 6:661-671.
4. Walsh C A, Carron J A and Gallagher J A (1996) The
isolation of osteoclasts from human giant cell tumours and
long-term marrow cultures. In 'Human Cell Culture Protocols'
Ed. G.E. Jones, Humana Press Inc. pp 233-262.
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6. Sato M and Grasser W (1990) Effects of bisphosphonates
on isolated rat osteoclasts as examined by reflected light
microscopy. J. Bone Miner. Res. 5:31-40.
7. Boyde A (1991) Pitfalls in pit measurement. Calcif. Tissue
Int. 49:65-70.
8. Tamura T, Takahashi N, Akatsu T, Sasaki T, Udagawa N,
Tanaka S and Suda T (1993) New resorption assay with
mouse osteoclast-like multinucleated cells formed in vitro. J.
Bone Miner. Res. 8:953-960.
9. Itonaga I, Sabokbar A, Neale S D, and Athanasou N A
(1999) 1, 25 Dihydroxyvitamin D3 and prostaglandin E3 act
directly on circulating human osteoclast precursors. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 264:590-595.
一般使用说明
1. 牙质片层在已消毒的塑料容器中提供.仅允
许在无菌环境(如层流柜)中打开.
2. 打开容器后,需使用消毒镊子移开消毒棉塞.
然后片层应通过颠倒试管转移至已消毒的皮
氏培养皿.
3. 用细镊子将片层移至培养皿备用,注意不要
刮到牙质表层.该片层被设计可应用在标准
的96孔组织培养盘中,但是它们也能在任何
类型的组织培养容器中使用.
4. 在增加细胞之前,牙质片层应被预加湿至少1
小时.应使用消毒磷酸盐缓冲液或组织培养
方法.
5. 去除预加湿液后,加入细胞悬浊液.加入的
细胞数量取决于破骨细胞来源和实验设计.
重吸收由光显微镜法进行分析,这样就有可
能测量单个破骨细胞的活性.然而,在大部
分实验方案中,加入更多的破骨细胞将更合
适(但是一般要少于200/牙质片).
6. 使用的沉淀时间也取决于破骨细胞来源和实
验设计.成熟的破骨细胞将在1小时内附在牙
质片层,但是在许多方案中将需要更长的沉
淀时间.培养基能通过使用包括自动移液管
在内的标准组织培养技术和设备而被改变.
7. 由成熟破骨细胞导致的重吸收在培养12小时
后可被检测出.培养的时间将取决于实验设
计.
8. 如果使用液态固定液,牙质片层可在组织培
养容器中固定.撤除受限的培养基且用磷酸
盐缓冲液或组织培养基冲洗组织培养孔两
次,再加入固定液.常使用的固定液是4%的
戊二醛(用0.2M的甲胂酸钠溶液配成).
9. 重吸收凹点能在多种标准组织学菌株着色后
鉴定.我们推荐1%的甲苯胺蓝(用0.5%四硼
酸盐溶液配成).牙质片层应在此甲苯胺溶
液中染色3分钟.多余的染料通过冲洗去除,
然后在非蒸馏水中漂洗并风干.已染色的片
层可即在室温下长期保存.
10. 重吸收陷窝能通过多种途径鉴定,包括扫描
电镜和光学显微镜.我们推荐使用反射光学
显微镜.
11. 使用者应考虑一些推荐的方法以确定最合适
他们需要的技术.
举例体外产生人破骨细胞的方法
这个方法使用20 mL的外周血细胞将可提供适用
于近50个牙质片层的足够的破骨细胞.
1. 准备已消毒的牙质片层并置于96孔板的微孔
中.每孔一个牙质片层.加入100 L的最低必
需培养基(MEM) 加10%的小牛胎血清(FCS)
到每个预湿的牙质片层孔中.
2. 混合20 mL的肝素抗凝的外周血和20 mL的
MEM .准备有5个5 ml Histopaque9(∑)的
Falcon试管并加入8 ml的外周血细胞悬浮液.
在450 g下离心30分钟并轻轻倒出淡黄色表面
层.
3. 在10 mL的MEM 清洗淡黄色表面层并在
1500 rpm离心20分钟.重悬浮的细胞小球在4
mL的MEM 加10% FCS并使用血球仪计算细
胞数量(注意:细胞的浓度将取决于淡黄色表
面层的效率).
4. 一旦细胞计算出数量加入大约20 l的约
500,000细胞介质到96孔板的每个微孔中.放
入孵育器并离开1小时.
5. 在孵育期后每孔用抽出的介质清洗3次并加入
新鲜的介质.最后用100 l的新制成的MEM
加10% FCS代替,加入RANK ligand (30 ng/mL)
和M-CSF (25 ng/mL).
6. 每2至3天更换介质溶液.破骨细胞将在2周后
形成并且这个过程可以用牙质片层的消减和
染色进行监测.
7. 在最开始培养的2个星期,潜在催化剂的作用
或骨染色体异常转化抑制剂可加入到培养介
质中.
8. 在培养的第三个星期在牙质片层上出现广泛
的重吸收,在这个时期可以用于评估潜在抑制
或催化骨重吸收物质的效果.
9. 牙质片层用甲苯胺蓝染色和用反射显微镜分
析重吸收的程度.
其它骨位点产品
用于免疫诊断
PTHrP N-Terminal, PTHrP (1-34)
Rabbit Anti-Human Polyclonal Antibody - Code
RZ-AE-0402
PTHrP Mid-molecule, PTHrP (43-52)
Rabbit Anti-Human Polyclonal Antibody - Code
RZ-AE-0102
PTHrP Far C-Terminal, PTHrP (144-152)
Rabbit Anti-Human Polyclonal Antibody - Code
RZ-AE-0302(兔抗人多克隆抗体)
Osteoclast Antigen (破骨细胞抗原)
Mouse Anti-Human Monoclonal Antibody - Code
RZ- AE-4002(小鼠抗人单克隆抗体)
Osteoarthritis Matrix Antigen (骨关节炎矩阵抗原)
Mouse Anti-Human Monoclonal Antibody - Code
RZ-AE-6002