FDNB与蛋白质在室温，pH=8.0~9.0条件下反应，生成DNP-蛋白；随之，在105℃，6mol/LHCl条件下水解，生成DNP-氨基酸及其它游离氨基酸。由于DNP-氨基酸溶于乙醚，而其余氨基酸不溶，故用乙醚抽提出DNP-氨基酸，再将未知样的DNP-氨基酸与已知标准DNP-氨基酸在相同条件下进行纸层析，根据Rf值即可推断未知样N-末端为何种氨基酸。