置换色谱
置换色谱(d isp lacem en t ch rom atog rap hy) 作为一种非线性色谱技术, 是指样品输入色谱柱后, 用一种与固定相作用力极强的置换剂(d isp lacer) 通入色谱柱, 去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进, 使样品中各组分按作用力强弱的次序, 形成一系列前后相邻的谱带, 并在置换剂的推动下流出色谱柱。与其它色谱技术相比, 置换色谱有明显的优点, 即上样量大、产率高、分辨率好, 而且易于操作。同时, 被分离样品在分离过程中会自行浓缩。因此, 这一技术已越来越引起人们的关注。尤其对于生物产品, 由于其初始浓度非常低, 并与其它物质混处在同一复合物基质中, 而且在分离过程中要求仍然保持其生物活性, 所以将置换色谱技术应用于生物分子的制备性分离与纯化, 有着其它色谱技术不可替代的优势.
1. 分离机理
置换色谱是一种非线性色谱技术, 进样量大, 进样浓度较高。操作程序包括色谱柱的平衡、上样、加置换剂、洗脱、分步收集和色谱柱再生这一系列过程。样品的分离是由于被吸附组分之间对固定相吸附部位直接竞争作用的结果, 吸附较强的组分置换吸附较弱的组分, 并推动其向前移动。系统达到平衡后, 样品中各组分按照它们对固定相亲合力的大小形成一系列毗邻的样品区带, 即置换序列(disp lacem en t train) , 并在置换剂的推动下以相同的速度向前移动。当样品中各组分全部流出, 置换剂的前沿抵达色谱柱的出口时, 便完成了置换分离过程。色谱柱经再生处理, 就可以进行下一次操作。
2. 置换展开方式的优点与局限
虽然传统洗脱色谱和置换色谱的分离作用都是由于样品对固定相的作用力不同来实现的, 但两者的分离机理不同[ 4 ]。洗脱色谱中, 样品各组分的分离是由于它们对固定相作用的平衡常数不同, 导致各组分随流动相的流动有不同的移动速度。改变流动相的组成、离子强度或pH 值可以改变样品的吸附特性, 从而达到组分分离的目的。当样品各组分的吸附特性不同时, 洗脱色谱是简单而有效的。但当被分离的物质极相似时, 使用洗脱方式就很难使它们分离完全。同传统的洗脱色谱方式相比, 置换展开则有如下优点: (1) 允许上样量比洗脱色谱高得多, 尽管如此, 在置换分离过程中, 被分离组分仍能以相当高的纯度获得高产率; (2) 各组分在分离过程中能形成较清晰的界限, 消除了洗脱分析中的拖尾现象, 提高了样品组分的回收率; (3) 产物浓度的可控性;(4) 需要较少的溶剂; (5) 与亲和色谱不同, 可同时分离纯化几种物质。同制备色谱中其它两种常用的展开方式, 超载洗脱(overloading elution) 和前沿分析(frontal analysis) 相比, 该技术的特殊优点是: 一旦找到合适的分离条件, 样品中各组分的浓度在分离过程中会逐渐提高到操作线对应的浓度, 而且单位柱长的固定相利用率最高。
二、影响置换色谱分离的因素
1. 置换剂
(1) 置换剂的选择置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一。
理想的置换剂必须符合以下条件:
●与样品中其它组分相比, 对固定相的吸附力最强, 而且呈现L angm u ir 吸附行为;
●化学稳定性好, 不与样品中任何组分发生反应;
●易溶于流动相, 且能快速完成色谱柱的再生;
●易得到高纯度的产品, 因为置换剂中的杂质可能污染样品且增加色谱柱再生的难度;
●若分离后的产物混有置换剂, 置换剂应较易除去;
●无毒, 以符合药用及食用生物产品的法规要求
2. 固定相
理想的固定相应具备以下条件:
●样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用, 且吸附是可逆的;
●样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为L angm u ir 型;
●样品各组分在固定相上的吸附能力应有较大差别, 以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率;
●有较好的化学稳定性, 可适用于不同pH 值的缓冲液和有机溶剂;
●有较大的比表面及吸附容量;
●有较好的机械强度, 而且容易再生。
3. 流动相
作为置换色谱的流动相与所采用的固定相有很大的关系。流动相对样品应有足够大的溶解度, 以免样品溶液在分离过程中被逐渐浓缩, 超过饱和溶解度而发生沉淀。另外, 所选择的流动相应有较好的化学稳定性、低粘度、低毒性且较易和样品分离。传统上, 人们都是参考前人的工作及反复试验来选择合适的流动相, H uang[ 55 ] 等人则提出了用溶度参数的方法预测样品在溶剂中的溶解度及分子间的相互作用力和亲合力, 以筛选合适的流动相。Ho rvath等在流动相中加入添加剂或改性剂, 可以改变样品组分的保留行为, 提高多组分置换色谱的分离效果。在一定的条件下, 将有机改性剂加在流动相中对产量的影响与增加置换剂浓度有相似的结果。此外,
在离子交换置换色谱中, 流动相中盐的浓度对置换剂的置换效率和样品分离度都有影响 , 其中,流动相中盐的浓度对高分子量置换剂影响不大, 而低分子量置换剂宜选用高盐浓度的流动相。
4. 非Langm u ir 型等温线对置换行为的影响
置换色谱要求吸附等温线应是L angmuir 型,但是许多生物分子对吸附剂的吸附作用是不相同的, 有些并不呈现L angm u ir 型, 而且不同物质在同一吸附剂上的吸附等温线有时是交叉的, 这时置换色谱的分离情况就显得较为复杂, 有时甚至根本无法分离。