四氮唑比色法
原理皮质激素类的C17位的α-醇酮基具有还原性．在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲臜(formazan)，后者在可见光区有最大吸收。该反应在一定条件下可定量完成，且生成的有色甲臜具有一定的稳定性，可用于甾体激素类药物的含量测定。
四氮唑盐的种类最常用的四氯陛盐有两种：
(1)2，3，5-三苯基氮化四氮唑(2，3，5-triphenyltetramlium chloride，缩写为TTC)，简称为氯化三苯四氮唑或红四氮唑(red tetramline，RT)，其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲簪，在480~490nm波长处有最大吸收。氯化三苯四氮唑显色灵敏度较低，但空白吸收较小。
(2)蓝四氯陛(blue tetramline，BT)，即3，3’-二甲氧苯基-双4，4’-(3，5-二苯基)氮化四氮唑{3，3’-dianisole-bis[4，4’-(3，5-diphenyl)tetramlium chloride]}，其还原产物为暗蓝色的双甲簪，在252nm波长处有最大吸收。
应用示例以中国药典收载的醋酸氢化可的松软膏的含量测定为例，测定方法如下：1．对照品溶液的制备精密称取醋酸氢化可的松对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。2．供试品溶液的制备精密称取本品2.5g(相当于醋酸氢化可的松25mg)，置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴加热使溶解，再置冰水中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，如此提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。3．测定精密量取对照品溶液与供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液(取氯化三苯四氮唑lg，加无水乙醇使溶解成200ml)lml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液(取10％氢氧化四甲基铵溶液lml，加无水乙醇使成10ml)1ml，摇匀，在25℃的暗处放置40~45分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算即得。
讨论本法广泛用于皮质激素类的测定，但当药物被分解破坏(C17-α-醇酮基被氧化)后即无此反应。所以分解产物对本法无干扰，但在测定过程中受到各种因素的影响，如反应温度和时间、水分、PH值、氧和光线等。1．温度与时间的影响呈色速度一般随温度增高而加快，但在室温或30℃恒温条件下显色易得重现性较好的结果，反应时间视供试品和试剂的种类不同而异。中国药典多数在25℃暗处反应40~45分钟。2．取代基的影响反应原理是C21-羟基被四氮唑氧化，当C21-羟基酯化后，其反应速度较C21-羟基游离时的反应速度慢；酯化的酰基结构越复杂则反应速度越慢。3．空气及光线的影响反应及其产物对光及氧敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时在达到最大呈色时间后，立即测定吸收度。TTC法形成的产物对空气中氧敏感．显著影响颜色的强度和稳定性，因此英国药典规定在加入试剂后要往容器中充氮气。4．溶剂和水分的影响多数采用95％的乙醇，但有时为了减少整个反应液中水分的含最则采用无水乙醇。含水量过大会使呈色速度减慢，含水量不超过5％时．对结果几乎无影响。醇中的醛类杂质必须除去，因为少量乙醛会使吸收度增高，故一般使用无醛醇作为溶剂。5．碱的种类和浓度目前最常用的是氢氧化四甲基铵，能得到满意结果。一般用甲醇或乙醇将10％的氢氧化四甲基铵溶液稀释后再用，反应完毕后溶液中碱的浓度通常约为0.01mol/L。6．干扰物的影响有些还原性物质如抗坏血酸、还原糖、硫醇、多元酚等都能与四氮唑盐反应而引起干扰，但在甾体激素原料和制剂的分析中不易遇到。某些赋形剂如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT法有较显著的干扰，山梨醇和角鲨烯也有干扰，因此，测定油膏、冷霜等制剂时必须先分离才能测定。